нанотела

http://www.sciam.ru/article/2796/

Архив

ноябрь 2005
Инновации

НАНОТЕЛА

Уэйт Гиббс

Маленькие дети часто путают реальный объект и его модель, пока не привыкнут к тому, что одна вещь может олицетворять другую. Такие ошибки показывают, насколько трудно развивается абстрактное, в том числе символическое, мышление.

Нанотела нескольких типов (пурпурные) могли бы одновременно атаковать раковую клетку (зеленовато-голубую). Одни - связывались бы с рецепторами клетки, не давая ростовым сигналам доходить до клетки. Другие - доставляли бы радиоактивные изотопы непосредственно в раковые опухоли.
Нанотела нескольких типов (пурпурные) могли бы одновременно атаковать раковую клетку (зеленовато-голубую). Одни - связывались бы с рецепторами клетки, не давая ростовым сигналам доходить до клетки. Другие - доставляли бы радиоактивные изотопы непосредственно в раковые опухоли.

Часто мы представляем себе антитела чем-то вроде волшебных пуль. На самом деле они больше похожи на танки: большие, сложные и дорогие. Однако более мелкие нанотела могут справиться с различными заболеваниями и за меньшую цену.

Иммунная система человека устроена чрезвычайно сложно. Вокруг нас простирается мир, кишащий бесконечно разнообразными микроорганизмами. От их нападения нас защищают антитела, которые производятся B-лимфоцитами. Антитела представляют собой огромные Y-образные молекулы белка, которые плавают в крови и межклеточной жидкости и с помощью своего химического осязания проверяют все молекулы. Каждая модель антител ждет однозначной химической подписи конкретного микроба, аллергена или токсина.

Однако, несмотря на совершенство нашей иммунной обороны, мы можем заболеть. Иногда иммунная система дает сбой: то она слишком медлительна, то вдруг проявляет неоправданную деликатность (например, по отношению к раку или к респираторному синциальному вирусу), то бурно отторгает транс-плантированные органы. А когда она по ошибке атакует собственные клетки организма, то сама иммунная реакция может вызвать дегенеративное заболевание, например, ревматоидный артрит.

На протяжении многих лет ученые пытались создать искусственные антитела, которые могли бы корректировать (или хотя бы частично смягчать) ошибки иммунной системы. В 1975 г. был открыт способ создания идентичных, или моноклональных, антител, однако с мертвой точки удалось сдвинуться лишь в 1997 г., а к концу 2004 г. было одобрено терапевтическое применение 17 антител. Предполагается, что препараты будут эффективны при лечении рака, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника и, возможно, болезни Альцгеймера.

Рынок моноклональных антител (МАТ) все еще формируется. Десятки новых МАТ находятся на стадии разработки или клинической проверки. В 2004 г. Джанис Рейкерт (Janice M. Reichert) из Центра по изучению процесса разработки лекарственных препаратов при Университете Тафта предположила, что 16 из них получат лицензии FDA в течение трех лет. Согласно ее предсказаниям, в 2008 г. объем торговли МАТ составит во всем мире около 17 млрд. долларов.

Беда с антителами

Лама из лаборатории компании Ablynx производит специфичные для семейства верблюдов антитела - исходный материал для нанотел.
Лама из лаборатории компании Ablynx производит специфичные для семейства верблюдов антитела - исходный материал для нанотел.

Несмотря на то что у моноклональных антител большие перспективы, их применение обходится отнюдь не дешево. Например, лечение больных астмой антителами Xolair стоит 11 тыс. долларов в год, а годовой курс лечения Herceptin от рака - более 38 тысяч. Remicade от ревматоидного артрита обойдется в 4,6 тыс. долларов за восемь уколов.

По молекулярным меркам МАТ - просто гиганты, каждое из них представляет собой комплекс из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей, свернутых замысловатым образом и сдобренных сложными сахарами. Чтобы создать лекарство на основе МАТ, ученые обычно начинают с антитела, взятого от мыши. Затем они гуманизируют молекулу, манипулируя с кодирующими ее генами, чтобы заменить часть или весь белок аминокислотными последовательностями, скопированными из человеческих антител. (В качестве альтернативы у некоторых компаний есть генетически модифицированные мыши, которые производят почти человеческие антитела.)

Такая гуманизация снижает потенциально опасные побочные эффекты, часто возникающие при лечении антителами, когда иммунная система пациента воспринимает МАТ как инородные вещества и атакует их. Однако процесс гуманизации требует многих месяцев высокотехнологичного труда, а получающиеся в результате макромолекулы настолько сложны, что их нельзя синтезировать из химических строительных кирпичиков, как это происходит с обычными лекарственными препаратами. Вместо этого их приходится получать с помощью клеток млекопитающих в специально оборудованных чанах-биореакторах, в которые вводится множество генов, необходимых для производства всего одного антитела.

Большие размеры белков накладывают ограничения как практического, так и медицинского характера. Высокие температуры или колебания кислотности заставляют полипептидные цепочки раскручиваться, если их не хранить при температуре около 0°C, то они теряют годность всего за несколько недель. Антитела быстро перевариваются в кишечнике, они не могут попасть в мозг, им доступны лишь края плотных опухолей. По этой причине многие болезни для МАТ недосягаемы.

При некоторых заболеваниях, когда МАТ не эффективны, могут помочь более простые полипептиды меньшего размера.

В 80-х гг. ученые начали экспериментировать с фрагментами антител, полученных при отделении от Y-образной молекулы ствола, оставляя для выполнения химических обязанностей всего одну ветвь антитела. Как и полноценные МАТ, фрагменты антител могут лечить заболевания, связываясь с токсинами, патогенами или сигналами аберрантных клеток или же с теми клеточными рецепторами, с которыми связываются "агрессоры". Однако в отличие от полноценных антител, подобные фрагменты не могут вовлечь в работу такие компоненты иммунной системы, как клетки-киллеры, или Т-лимфоциты, поскольку они не обладают полипептидным стволом, ответственным за выполнение этой задачи.

Фрагменты антител можно производить с помощью бактерий, дрожжей или грибов. С одной стороны, они могут проникать вглубь опухолей, и к ним можно химически прикрепить радиоактивные изотопы или химиотерапевтические препараты, которые будут доставлены непосредственно в больную ткань. С другой - фрагменты антител быстро исчезают из кровяного русла, поэтому время их полужизни составляет лишь несколько часов, в то время как настоящие антитела могут существовать в организме неделями.

Английская компания Domantis укоротила фрагменты человеческих антител еще больше, оставив всего лишь кончик тяжелой цепи и полностью удалив легкую. Этот сегмент, уникальный для каждого антитела, содержит участки, определяющие комплементарность (CDR), от которых зависит, какую мишень будет распознавать данное антитело и насколько сильной будет их связь в случае встречи. В результате получаются доменные антитела (так Domantis называет свои полипептиды).

Однако доменные полипептиды получены как сегменты значительно более крупных двухцепочечных антител, что делает их склонными к прочному связыванию, объясняет Серж Мулдерманс (Serge Muyldermans), специалист по бел-кам из Свободного Брюссельского университета. В результате фрагменты слипаются друг с другом внутри бактерий, в которых они производятся, а также в организме принимающего их пациента.

 АНАТОМИЯ АНТИТЕЛА

Миллионы разновидностей человеческих антител представляют собой вариации одной и той же базовой структуры: две более крупные (или тяжелые) цепи соединены с двумя цепями меньшего размера (или легкими). Пара вариабельных сегментов на концах ветвей уникальна для каждого типа антител и определяет, с какой мишенью оно будет связываться. Нанотело - это вариабельная часть верблюжьего антитела, в котором исходно отсутствуют легкие цепи. По размерам оно в десять раз меньше антитела.

Миллионы разновидностей человеческих антител представляют собой вариации одной и той же базовой структуры: две более крупные (или тяжелые) цепи соединены с двумя цепями меньшего размера (или легкими). Пара вариабельных сегментов на концах ветвей уникальна для каждого типа антител и определяет, с какой мишенью оно будет связываться. Нанотело - это вариабельная часть верблюжьего антитела, в котором исходно отсутствуют легкие цепи. По размерам оно в десять раз меньше антитела.

От верблюда к лекарству

В то время как биохимики работают над созданием фрагментов антител, лишенных перечисленных недостатков, бельгийская биотехнологическая компания Ablynx воспользовалась альтернативой, предложенной самой природой. В 1989 г. Мулдерманс работал в составе группы биологов в Свободном Брюссельском университете, возглавляемой Раймондом Хамерсом (Raymond Hamers). Ученые исследовали проблему защиты одногорбых верблюдов и буйволов от паразитов. Один из анализов антител в крови животных выглядел как ошибочный: согласно его результатам, в дополнение к нормальным четырехцепочечным антителам были выявлены более простые антитела, составленные всего из пары тяжелых цепей.

Потратив несколько лет на исследования, Хамерс и Мулдерманс в 1993 г. опубликовали статью о своем открытии в журнале Nature. У одногорбых верблюдов (а также двугорбых из Азии и южноамериканских лам) половина антител в крови лишена легких цепей. Столь же удивительным оказалось и то, что "неполноценные" антитела связываются со своими мишенями так же прочно, как и нормальные, хотя и обладают всего половинным количеством участков, определяющих комплементарность. В отличие от фрагментов антител, антитела из одних тяжелых цепей друг с другом не слипаются.

Почему верблюды отличаются от всех остальных млекопитающих, до сих пор остается загадкой. Когда ученые из группы Мулдерманса вырезали из новых молекул характерные вариабельные сегменты, то оказалось, что они сохранили сильную аффинность по отношению к своим мишеням, практически такую же, какой обладают в десять раз более крупные полноценные антитела. К тому же укороченные белковые молекулы были очень подвижны, что позволяло им связываться с мишенями, в том числе с активными сайтами ферментов и с молекулами внутри щелей в клеточных мембранах, которые слишком малы для антител. Так родились нанотела, а вслед за ними и компания Ablynx.

 КОНСТРУИРОВАНИЕ АНТИТЕЛ И НАНОТЕЛ
Создание эффективного нанотела требует меньше времени и денег, чем для разработки антител. В обоих случаях иммунная система живого животного осуществляет начальное "проектирование" белка, который может связываться с молекулой-мишенью. Затем генетики орудуют с ДНК, кодирующей эту полипептидную последовательность, чтобы привнести новые свойства, необходимые лекарству.

ТРАДИЦИОННЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА

1. Иммунизация

Исследователи вводят мыши молекулу-мишень. B-лимфоциты ее иммунной системы производят антитела, распознающие этот антиген.

1. Иммунизация

2. Слияние, отбор и тиражирование

Слиянием B-лимфоцитов (голубого цвета) с раковыми клетками миеломы (оранжевого цвета) получают гибридомы (фиолетового цвета), способные к бесконечному делению.

Клетки гибридомы, производящие нужное антитело, идентифицируют и выращивают в культуре.

2. Слияние, отбор и тиражирование

3. Получение антител

Культура клеток выделяет антитела, которые затем очищают и проверяют.

3. Получение антител

4. Гуманизация

Генные инженеры могут заменить участки мышиного антитела сегментами человеческого антитела (золотистого цвета), могут также разрезать антитела, создавая фрагменты различного размера.

4. Гуманизация

НАНОТЕЛА КОМПАНИИ ABLYNX

1. Иммунизация

Ламу иммунизируют, и в ее организме вырабатываются как нормальные антитела (слева), так и состоящие из одних тяжелых цепей (справа).

1. Иммунизация

2. Изоляция и клонирование

Взяв пробу крови, ученые обнаруживают клетки, производящие антитела, состоящие лишь из одних тяжелых цепей. Затем они находят участок ДНК с геном, кодирующим данное антитело.

2. Изоляция и клонирование 3. Генная инженерия

3. Генная инженерия

Генетики обрезают ДНК, оставляя лишь кусочек, кодирующий единичный вариабельный участок - нанотело. Множество слегка различающихся нанотел проверяют, чтобы выделить наиболее пригодные для медицинского применения.

4. Сборка

Гены нанотел можно соединить с генами других нанотел или другими веществами, создавая лекарства, синтезируемые затем культурами бактерий, грибов или дрожжей.

4. Сборка


Поскольку нанотела намного мельче антител и не обладают гидрофобностью (в отличие от доменных антител), они более устойчивы к температуре и кислотности. Петер Роттирс (Pieter Rottiers) и Хильда Реветс (Hilde Revets) из Института биотехнологии Фландерса в Бельгии показали, что такие соединения сохраняют свою активность при прохождении через желудочно-кишечный тракт мышей, что внушает надежду на создание таблеток с нанотелами для лечения воспалительного заболевания кишечника, рака прямой кишки и других заболеваний пищеварительной системы.

Поскольку нанотела проще антител по химическому строению и форме, они могут быть закодированы в одном гене, и микробам легче их синтезировать. В 2002 г. биологи из компании Unilever Research в Нидерландах получили более килограмма нанотел из стандартного чана объемом в 15 тыс. литров с дрожжами (выход составил 67 мг на литр), в то время как ученые из Ablynx сообщили о выходе, превышающем один грамм нанотел на литр культуры дрожжей (производительность, намного превышающая таковую для полноразмерных антител). "К тому же наши нанотела стабильны при комнатной температуре и могут долго храниться без холодильника", - утверждает Тим ван Хаувермейрен (Tim Van Hauwermeiren), ответственный за расширение бизнеса компании.

Дни после трансплантации опухоли

Нанотела против рака были испытаны на мышах, которым ввели опухолевые клетки человека. Обычная химиотерапия просто задержала развитие рака, в то время как химиотерапевтическое воздействие в высоких дозах с применением нанотел привело к выздоровлению.

"Создавать новые типы нанотел не так уж и сложно, - утверждает ван Хаувермейрен. - Иммунизируя лам необходимым антигеном и извлекая затем лишь антитела, состоящие из одних тяжелых цепей, мы можем получить высокоаффинные нанотела к заданному антигену всего за четыре месяца". При некоторых заболеваниях, в том числе при ревматоидном артрите, нанотело может выполнять задачу само по себе, заглушая патогенные клеточные сигналы путем связывания с сигнальной молекулой, либо путем блокирования рецепторов сигнала, расположенных на поверхности клеток.

Одно из главных преимуществ нанотел состоит в том, что они достаточно легко соединяются друг с другом или же с самыми разнообразными веществами. Хаард соединил нанотела к альбумину с нанотелами к специфическим мишеням, в результате чего их время полужизни в кровяном русле возросло до недель. Он объединил четыре нанотела, создав "мультивалентные" комплексы, которые могут связать больше антигена в расчете на одну молекулу или же связываться с одной из двух различных мишеней или с обеими одновременно.

Недавно Реветс и Мулдерманс опубликовали результаты экспериментов по созданию нанотел, связывающихся с рецепторами на раковых клетках, в результате чего эти молекулы присоединяются ко всем опухолям. Исследователи наделили такие группы двойной функциональностью, связав их с ферментом, который превращает другое вещество, называемое пролекарством, из безобидной формы в токсический химиотерапевтический препарат, который убивает клетки, располагающиеся в непосредственной близости.

Эксперименты проводились на мышах, которым ученые ввели человеческие раковые клетки, вскоре разросшиеся в опухоли размером в полтора сантиметра. Для одной группы грызунов Реветс применяла только химиотерапию. Зверьки плохо себя чувствовали и теряли в весе, а опухоли уменьшились лишь незначительно. Другой группе мышей ввели высокую дозу нанотел с двойной функциональностью, в состав которых был включен фермент. Подождав, пока свободные нанотела выйдут из организма, ученые ввели пролекарство. Ожидания оправдались: нанотела направили химиотерапию на раковую опухоль, щадя при этом здоровые ткани, и обеспечили полное рассасывание опухолей.

Пока нанотела не пройдут клинические испытания, никто не сможет сказать, будут ли они работать в организме человека так же эффективно, как в организме мышей. Но если у них и найдут недостатки, то связаны они будут с иммунной системой. Ученые из Ablynx разработали способы гуманизировать нанотела, а исследования на бабуинах показали, что у них не возникает иммунного ответа на эти небольшие белки, полученные от лам. Однако Хаард признает, что нанотелам не удастся ускользнуть от более сложной сети клеточного наблюдения, которая защищает людей. Результаты клинических испытаний, намеченных на следующий год, покажут, удастся ли нанотелам продолжить свой стремительный успех, либо же они падут жертвой совершенства иммунной системы человека.





Comments